HDACi联合ATRA重启宫颈癌细胞RARβ2表达及其抗肿瘤机制研究

【摘要】宫颈癌最常见的女性生殖道恶性肿瘤,发病率和病死率居生殖道恶性肿瘤首位。每年全世界大约有53万新发病例,约50%患者死于该疾病,其中的80%来自发展中国家。早期宫颈癌一般推荐采用手术治疗,对于晚期转移和复发的病例,则失去了手术机会,常规采用化疗和放疗。然而,由于耐药的发生,患者身体耐受状况的恶化,放、化疗效果十分有限。因此,深入探讨宫颈癌发病机制,寻找更为安全有效、靶向性强的宫颈癌防治办法意义重大。靶向抑制组蛋白脱乙酰化酶(histonedeacetylase,HDAC)是一种目前非常有前景的肿瘤治疗手段。组蛋白的乙酰化修饰是一种重要的基因表达调控模式,由HDAC和组蛋白乙酰化转移酶(histoneacetyl-transferase,HAT)共同调节。研究证实,脱乙酰化作用过度,导致一系列肿瘤抑制基因下调／沉默,在肿瘤的发生过程起到关键作用；在宫颈癌组织中,HDAC活性异常增高；宫颈脱落细胞学发现组蛋白H3乙酰化水平与宫颈上皮内瘤变(cervivalintraepithelialneoplasia,CIN)程度相关。因此,组蛋白脱乙酰化酶抑制剂(histonedeacetylaseinhibitor,HDACi)是一种潜在的宫颈癌靶向治疗药物。全反式维甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)是一种上皮细胞生长和分化的调节剂,可以诱导发生转化的细胞重新进入分化程序,而被用于肿瘤的防治。ATRA与受体(retinoicacidreceptor,RAR)结合,尤其是RARβ2,才能发挥抗肿瘤作用。RARβ2作为一种重要的肿瘤抑制基因,由于启动子区域的甲基化和／或去乙酰化修饰而在包括宫颈癌在内很多肿瘤中的表达被沉默。有研究报道,HDACi可以上调多种肿瘤RARβ2的表达。因此,HDACi联合ATRA能否重启宫颈细胞RARβ2的表达,并发挥协同抗肿瘤作用值得深入研究。本课题将分析临床宫颈癌组织中组蛋白乙酰化水平与肿瘤抑制基因(Tumorsuppressorgenes,TSGs)表达及相关病理参数的关系；深入探讨HDACi(VPA和SAHA)联合ATRA对宫颈癌细胞RARβ2的表达的影响,从表观遗传修饰角度来阐明调控机制；通过体外实验,研究HDACi联合ATRA的抗宫颈癌作用,并深入探讨分子机制；建立人宫颈癌移植瘤模型,进一步评价疗效和验证分子机制。主要研究结果如下：1宫颈癌组织中组蛋白乙酰化水平和RARβ2及其下游基因的表达显著降低,甚至缺失：选取高、中、低分化的宫颈鳞癌组织65例,免疫组化检测AcH3、RARβ2、E-cadherin和β-catenin的表达并评分。结果显示,随着宫颈癌组织分化程度的降低,AcH3、RARβ2、E-cadherin和p-catenin的表达逐渐降低、甚至缺失；组蛋白H3的乙酰化水平与RARβ2、E-cadherin和β-catenin的表达呈显著的正相关性(r=0.560,r=0.731,andr=0.733,P均<0.01)。表明,宫颈癌的进展过程中存在表观遗传修饰的异常,后者可能参与调控肿瘤抑制基因RARβ2.E-cadherin和β-catenin的表达。2HDACi联合ATRA显著提高宫颈癌细胞株AcH3水平,重启RARβ2表达：HDACi联合ATRA处理宫颈癌细胞株HeLa和SiHa48h后,基因表达谱芯片和Q-PCR结果证实RARβ2表达重启,转录水平显著上调,而RARα和RARγ则为组成性表达；WB显示组蛋白乙酰化水平显著提高,RARβ2表达量显著上升。3AcH3与RARβ2启动子区域RARE结合,启动RARβ2表达：以往研究证实,组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化与基因转录活化相关。我们采用H3K9ac抗体进行ChIP实验,结果显示HDACi联合ATRA通过提高H3K9ac水平,后者再与RARβ2启动子区RARE结合,从而重启RARβ2表达。4HDACi联合ATRA显著抑制宫颈癌细胞增殖1)HDACi联合ATRA抑制宫颈癌细胞增殖能力：MTT实验显示,HDACi与ATRA联合有效抑制宫颈癌细胞增殖,细胞增殖抑制率显著高于VPA和ATRA单一应用(P<0.01),甚至优于1mgL顺铂对宫颈癌细胞的抑制作用(P<0.01)；ATRA对pIRES2-RARβ2-EGFP稳转宫颈癌细胞株的抑制作用与联合用药效果无显著差异(P>0.05),表明HDACi重启宫颈癌细胞RARβ2表达,提供了与ATRA协同抗肿瘤作用的分子基础。药物处理后,Ki67的表达明显减少,细胞集落形成能力被显著抑制,联合用药效果优于任一药物单用(P<0.01),再次验证了HDACi和ATRA的协同／相加抑制宫颈癌细胞增殖的作用。2)HDACi联合ATRA引起宫颈癌细胞G1期阻滞：HDACi和ATRA处理宫颈癌细胞株48h后检测细胞周期,结果显示联合用药使细胞株发生G1期阻滞；WB结果表明,HDACi和ATRA显著上调P21CIP1和P53的表达,而p-Stat3水平显著降低,CyclinD1水平仅轻微下调。3)HDACi联合ATRA诱导宫颈癌细胞分化：细胞进入分化程序前需脱离细胞周期,WB和免疫组化结果证实,HDACi联合ATRA显著提高上皮细胞分化标志物Filaggrin、Loricrin、和Involucrin的表达；FACS和WB结果显示,药物处理后未引起细胞凋亡的显著增加。4)HDACi联合ATRA通过E-cadherin/PI3K/Akt通路诱导细胞分化：WB显示药物联合处理上调E-cadherin/β-catenin和p-Akt水平；分别采用LE-135拮抗RARβ2、siRNA沉默E-cadherin、LY-294002抑制PI3K活性、和siRNA沉默Akt1/2表达,可以阻断诱导分化作用。表明,HDACi联合ATRA重启RARβ2表达,通过E-cadherin-PI3K/Akt通路诱导宫颈癌细胞分化。5HDACi联合ATRA抑制裸鼠皮下移植瘤的生长：分别将5×106HeLa和SiHa细胞裸鼠背部皮下注射,建立移植瘤模型。治疗4周后,联合用药显著抑制肿瘤生长,肿瘤体积显著小于VPA组和ATRA组(P<0.01),与顺铂治疗组无显著差异(P>0.05)。与体外实验结果一致,WB显示药物联合处理显著提高组蛋白乙酰化水平,重启宫颈癌细胞RARβ2并上调P21CIP1和P53的表达,而Stat3磷酸化水平显著降低。免疫组化显示,联合药物处理抑制Ki67表达,增强上皮细胞终末分化标志Filaggrin、Loricrin、和Involucrin的表达。6建立人宫颈癌组织裸鼠皮下移植瘤模型,验证HDACi联合ATRA对宫颈癌的治疗作用1)HDACi联合ATRA抑制人宫颈癌组织移植瘤的生长：收集人低分化宫颈鳞癌组织,经过裸鼠皮下2次移植建立移植瘤模型。药物治疗4周后,联合用药显著抑制肿瘤生长(P<0.01),对照组、VPA组、ATRA组和联合用药组肿瘤平均体积分别316.65±94.58mm3,119.83±7.74mm3,and208.64±76.61mm3,66.84±19.10mm3；肿瘤抑制率(percentageoftumor-growthinhibition,%TGI)分别为59.39%,37.58%,和73.33%。2)HDACi联合ATRA诱导移植瘤分化及细胞凋亡：药物治疗4周后,剥离肿瘤组织,HE染色可见联合治疗组出现细胞角化和少量角化珠形成,未见核分裂相,而对照组仍维持来源宫颈癌组织的低分化状态,核分裂相多见。免疫组化显示,HDACi联合ATRA抑制Ki67表达,提高AcH3、RARβ2、及Loricrin、和Involucrin的表达；TUNEL检测显示,VPA治疗后凋亡细胞增加,联合治疗组凋亡细胞增加最为显著(P<0.01)。3)HDACi联合ATRA通过表观遗传调控机制重启RARβ2而发挥抗肿瘤作用：药物治疗4周后,免疫组化和WB结果表明组蛋白H3乙酰化水平显著提高；ChIP结果显示,H3K9ac可以与RARβ2启动子核心区域RARE结合,从而启动RARβ2的表达；与体外实验结果一致,Q-PCR和WB结果显示重启RARβ2表达后,其下游E-cadherin和上皮细胞分化标志物Involucrin和Loricrin的表达显著上调；同时P21CIP1、P53和活化的Caspase3表达上调,Stat3磷酸化水平显著降低,Bcl2的表达出现下调。综上所述,HDACi单独和联合ATRA可以通过表观遗传途径重启宫颈癌细胞RARβ2的表达,继而提供了两者协同／相加抗肿瘤作用的分子基础；HDACi联合ATRA使宫颈癌细胞脱离细胞周期,通过E-cadherin/PI3K/Akt通路诱导细胞分化是其抗肿瘤作用的主要机制,细胞凋亡也发挥了一定作用。本研究不仅进一步完善了宫颈癌的发病机制,而且阐明了HDACi联合ATRA对宫颈癌诱导分化治疗的效果及信号途径,为临床宫颈癌的防治提供了新的策略,但是治疗效果还需要通过临床试验进一步验证和评价。
【作者】冯定庆；
【导师】马春红；
【作者基本信息】山东大学，医学免疫学，2014，博士
【关键词】宫颈癌；组蛋白脱乙酰化酶抑制剂；ATRA；ChIP；分化治疗；

【参考文献】
[1]姜炜.企业微博营销传播探究[D].上海外国语大学,新闻学,2013,硕士.
[2]赵新.Ti基合金表面复合纳米管阵列制备及功能化[D].哈尔滨工业大学,材料加工工程,2013,硕士.
[3]张焱,欧阳一鸣,王浩,汪曦东.数据挖掘在金融领域中的应用研究[J].计算机工程与应用,2004,18:208-211.
[4]耿挺.科研与产业在这里发生了“化合反应”[N].上海科技报,2014-10-24001.
[5]齐飞.基于故障覆盖度的列控系统安全分析方法的研究[D].北京交通大学,2014.
[6]贾媛媛.K_4Nb_6O_（17）的制备及其光催化降解酸性红染料废水的研究[D].武汉理工大学,环境工程,2004,硕士.
[7]贾雨婷.礁滩储层高精度孔隙度反演[D].成都理工大学,地质工程,2013,硕士.
[8]严黎黎.现代汉语反身代词“自己”及“他自己”的第二语言习得研究[D].安徽大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[9]赵景明.中小企业决策的信息保障研究[D].中国科学院研究生院（文献情报中心）,2002.
[10]钟波.近代中国大学校长治校理念与中国高等教育近代化[D].湘潭大学,专门史,2003,硕士.
[11]孙金山.政府投资与新疆经济增长关系实证研究[D].新疆财经大学,政治经济学,2013,硕士.
[12]赵金兰.刁泉矿山人员定位系统的设计研究[D].太原科技大学,控制工程,2013,硕士.
[13]沈鹏.MW级风力发电机主轴等温淬火球墨铸铁材料的研究[D].沈阳工业大学,材料加工工程,2013,硕士.
[14]刘超.小学英语教师专业发展需求内容研究[D].山西师范大学,课程与教学论,2014,硕士.
[15]何璨.基于物理混沌和轮廓波变换的数字水印算法研究[D].黑龙江大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[16]李洋.汉法同传信息缺失的原因分析[D].北京外国语大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[17]张伟.乡村题材在中国上世纪中叶与本世纪初的意辨[D].曲阜师范大学,美术学,2013,硕士.
[18]万维汉,万百五,杨金义.闪速炉的神经网络冰镍质量模型与稳态优化控制研究[J].自动化学报,1999,06:800-803.
[19]曹敏.后勤社会化形势下校外大学生公寓区规划与建筑设计研究[D].湖南大学,建筑设计及其理论,2003,硕士.
[20]李雅丽.初中语文体验式阅读教学探索[D].河北师范大学,教育,2012,硕士.
[21]周蕊.李权时统制经济思想研究[D].华中师范大学,社会史,2013,硕士.
[22]宋溢娟.阵发性房颤射频消融术后空白期内房性心律失常与房颤远期复发的关系[D].河南科技大学,内科学,2014,硕士.
[23]赵兴飞.荒谬境遇与人的抉择[D].西南大学,外国哲学,2014,硕士.
[24]周香.宽范围输入DC/DC变换器的研究[D].南京航空航天大学,电力电子与电力传动,2013,硕士.
[25]张姣.从宗教文本的翻译看中西翻译方法的相似性[D].西北大学,英语笔译（专业学位）,2014,硕士.
[26]张建.山楂叶总黄酮固体自乳化颗粒的研究[D].广东药学院,中药学,2012,硕士.
[27]马婷.甘肃省电力投资集团信息化管理问题和改进策略[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[28]刘章红.滚动轴承参数化建模系统与有限元分析研究[D].西南交通大学,机械工程,2014,硕士.
[29]陈晨.基于介电电泳技术的低维纳米材料组装[D].哈尔滨工业大学,2012.
[30]谢翔.网络题库管理系统的设计与实现[D].江西农业大学,农业信息化,2012,硕士.
[31]杨武川.浅谈英语复杂句的翻译[D].广东外语外贸大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[32]刘俊.高中英语写作教学中教师评阅反馈现状的调查研究[D].华中师范大学,学科教学,2012,硕士.
[33]秦亮曦,史忠植.多时间序列跨事务关联分析研究[J].计算机工程与应用,2005,27:10-12+173.
[34]刘国荣,罗毅平,万百五.非线性MIMO系统H_2/H_∞模糊输出反馈控制[J].控制与决策,2004,11:1228-1231+1236.
[35]许振新.Intel“强芯”[J].中国计算机用户,2001,45:37.
[36]高云璐.应急指挥系统中LBS推业务的研究与设计[D].南京邮电大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[37]李志国.大脑外侧裂静脉外侧段的显微解剖与临床意义[D].吉林大学,外科学,2013,硕士.
[38]郭良洽,刘倩,李国良,江桂斌.石墨烯-金属/氧化物纳米复合材料制备方法的研究[A].中国化学会环境化学专业委员会、中国环境科学学会环境化学分会、中国毒理学会分析毒理专业委员会.第六届全国环境化学大会暨环境科学仪器与分析仪器展览会摘要集[C].中国化学会环境化学专业委员会、中国环境科学学会环境化学分会、中国毒理学会分析毒理专业委员会:,2011:1.
[39]易斌.活性炭吸附-Fenton氧化处理高盐有机废水的研究[D].湖南大学,环境工程（专业学位）,2012,硕士.
[40]冯冬芹.石油化工自动化技术的应用与发展趋势[J].数字化工,2004,12:8-12.
[41]孙怡,鲜本忠,林会喜.断陷湖盆陡坡带砂砾岩体沉积期次的划分技术[J].石油地球物理勘探,2007,04:468-473+488+361-362.
[42]李兆坤.基于机器视觉的输送带纵向撕裂检测装置的研究[D].西安科技大学,机械工程,2014,硕士.
[43]黄益,阮殿波,傅冠生.Li_4Ti_5O_(12)锂离子电池的研究和产业化进展[J].电池工业,2014,Z1:327-332.
[44]鄢文静.我国商业银行信用风险管理研究[D].西北工业大学,系统工程,2004,硕士.
[45]唐秀凤.运用全面质量管理-PDCA循环法提升汽车油箱质量管理研究[D].吉林大学,工业工程,2014,硕士.
[46]李畅.基于统计的分类算法及其在潜在客户识别中的应用研究[D].湖南大学,2004.
[47]宇清.基于顺应论的中美政治语篇中模糊限制语的对比研究[D].安徽大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[48]倪秀清.电信IP决策支持系统中数据仓库及数据挖掘的研究与应用[D].南京理工大学,2004.
[49]包福鹏.无线传感器网络的节点定位算法研究[D].东北大学,信号与信息处理,2010,硕士.
[50]孙海龙,孙维生,李文静.某产品装填机构设计改进[J].一重技术.2007(02)